原代培養(yǎng)的基本過(guò)程包括取材、 培養(yǎng)材料的制備、 接種及培養(yǎng)等步驟，原代培養(yǎng)的方法很多，基本和常用的是組織塊培養(yǎng)法和分離細(xì)胞法。

1)用培養(yǎng)液濕潤(rùn)所取組織材料，并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結(jié)締組織去除干凈。再用平衡液 (PBS )或 Hanks 液漂洗; 用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成小塊; 再用 PBS或 Hanks 液漂洗多次，直至液體不渾濁、無(wú)油滴、清亮為止。

2)用濕潤(rùn)的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并將其按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上，量不要過(guò)多，要將組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。

3)將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對(duì)側(cè)面加足培養(yǎng)液，勿使組織塊與培養(yǎng)液接觸，塞緊瓶塞。

4)將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于 37℃培養(yǎng)箱中;待組織塊貼壁 1h 到 3h 后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒(méi)與培養(yǎng)液中，靜置。

5)每隔 2 到 3 天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時(shí)間。

1)剛接種后，組織塊粘附不牢固，觀察和轉(zhuǎn)移過(guò)程中動(dòng)作要輕，以防引起液體振蕩，使組織塊漂起。

2)培養(yǎng)初期，要注意觀察有無(wú)細(xì)菌、霉菌污染。

3)原代培養(yǎng)要及時(shí)觀察，記錄。

4)過(guò)3-5天，需要換液以除去漂浮組織塊和殘留的血細(xì)胞，保證原代細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

1)首先用細(xì)胞分散法收獲細(xì)胞，隨時(shí)吸取少量消化液在鏡下觀察，并根據(jù)組織是否分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，采取終止消化措施。用篩網(wǎng)濾掉未消化的組織塊。

2)低速離心細(xì)胞懸液，棄掉上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。

3)根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求，用吸管吸取一定量的細(xì)胞懸液，加到培養(yǎng)瓶中。對(duì)于需要特殊底物的細(xì)胞，要先將底物涂一層于培養(yǎng)瓶皿底壁，然后接種細(xì)胞。

4)將培養(yǎng)瓶放入 37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

5)每隔 2 到 3 天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時(shí)間。

1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí)，雖然被分散成單個(gè)細(xì)胞，但它們之間的互相影響還是存在的， 而且這種影響對(duì)細(xì)胞能否存活是非常重要的。在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì)， 使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng)。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)低， 細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小， 雖然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充足， 也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過(guò)程。 如果接種的細(xì)胞密度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足， 代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

2)原代培養(yǎng)時(shí)初始培養(yǎng)在組織分散和分離細(xì)胞時(shí)細(xì)胞可能會(huì)受到嚴(yán)重的損傷。適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度， 給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用， 會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

3)由于細(xì)胞之間的相互的內(nèi)在聯(lián)系被打破，分離細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷的生存環(huán)境改變很大，在體外存活和生長(zhǎng)的難度相應(yīng)增加。 對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞來(lái)說(shuō)，盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3h 到 5h，由于細(xì)胞懸液中帶有少量培養(yǎng)液， 細(xì)胞即可以維持存活， 又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁， 是細(xì)胞迅速黏附于底物，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1)制備細(xì)胞懸濁液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。

2)在培養(yǎng)皿中加入足夠的培養(yǎng)液。

3)將欲接種的細(xì)胞接種到培養(yǎng)器皿中。

4)在培養(yǎng)皿內(nèi)放入一個(gè)有聚四氟乙烯包被的磁棒。將培養(yǎng)皿封口，送入恒溫箱內(nèi)。在磁力攪拌器上邊攪拌邊培養(yǎng)。若接種培養(yǎng)瓶或試管中，封口后可將培養(yǎng)器皿固定在恒溫?fù)u床上，邊搖動(dòng)邊培養(yǎng)，無(wú)需放置磁棒。有些細(xì)胞也可以不用磁棒或磁力攪拌器，也不必使用恒溫?fù)u床，接種于預(yù)先用硅脂包被的培養(yǎng)器皿內(nèi)直接在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)即可。

5)培養(yǎng)液略呈黃色換液。吸出部分舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液即可。

1)進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以 5ml 為限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快， 否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。 如果培養(yǎng)液的量在 5ml 以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。

2)能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。

1）在原代培養(yǎng)的 1 天到 2 天內(nèi)，要特別注意觀察是否有細(xì)菌、真菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，防止造成其它細(xì)胞的交叉感染；

2）隨著培養(yǎng)的進(jìn)程，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸的消耗，營(yíng)養(yǎng)成分越來(lái)越少，細(xì)胞代謝產(chǎn)物越來(lái)越多，有細(xì)胞呼吸過(guò)程中釋放出來(lái)的 CO 2 及其它產(chǎn)物如乳酸、丙酮酸等也逐漸增加。隨著酸性物質(zhì)的增加，培養(yǎng)液中的 pH值越來(lái)越低，培養(yǎng)液的顏色也越來(lái)越黃。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，要注意培養(yǎng)液顏色的變化，并根據(jù)培養(yǎng)液的顏色來(lái)決定換液時(shí)間。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色;當(dāng)培養(yǎng)液呈橙黃色時(shí)，細(xì)胞一般生長(zhǎng)情況良好;呈淡黃色時(shí)，可能培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞較多;呈紫紅色時(shí)， 可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好或已經(jīng)死亡。所以， 應(yīng)在培養(yǎng)液略黃時(shí)吸出部分舊培養(yǎng)液， 然后補(bǔ)加同等數(shù)量的新鮮培養(yǎng)液。換液過(guò)程中，不要吸出細(xì)胞，不要使培養(yǎng)液溢出培養(yǎng)瓶，避免各種微生物的污染。換液時(shí)，應(yīng)將培養(yǎng)液事先預(yù)溫至 37℃。

一般培養(yǎng)一天，組織細(xì)胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長(zhǎng)。 2 天到 3 天后，細(xì)胞恢復(fù)增殖活動(dòng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多， 消耗的營(yíng)養(yǎng)物越來(lái)越多， 需要換液的時(shí)間越來(lái)越短，當(dāng)細(xì)胞逐漸長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁并形成一單層細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞之間相互發(fā)生接觸和聯(lián)系，逐漸產(chǎn)生接觸抑制作用，培養(yǎng)物生長(zhǎng)速度減慢。 當(dāng)培養(yǎng)物最后形成一層完整的細(xì)胞單層時(shí)，生長(zhǎng)幾乎停止。在細(xì)胞高達(dá) 80%融合時(shí)就需要進(jìn)行傳代了。

1)原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強(qiáng)的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。

2)要注意無(wú)菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)

3)整個(gè)取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時(shí)間1min左右，不能過(guò)長(zhǎng)，以確保胚胎細(xì)胞活性。

4)運(yùn)用消化法時(shí)Pancreatic enzymes溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時(shí)消化細(xì)胞濃度的一半。因?yàn)榇诉^(guò)程不像消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的1~10min，而是至少20min，先消化下來(lái)的細(xì)胞在此Pancreatic enzymes消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以Pancreatic enzymes不能作用過(guò)強(qiáng)，否則這些細(xì)胞易被損傷而不易生存。

5)如使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時(shí)再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來(lái)。如果組織塊沒(méi)有黏壁，則細(xì)胞不易生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)也因沒(méi)有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無(wú)法收集到生長(zhǎng)的細(xì)胞。

6)原代培養(yǎng)操作時(shí)，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

7)本實(shí)驗(yàn)也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時(shí)要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應(yīng)小心操作，避免污染細(xì)菌。乳鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的存活率不及胚胎細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。