人白介素1β(IL-1β)化學發(fā)光免疫分析試劑盒操作說明

#: 一周內使用可存于 4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃。 
相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！ 
檢測原理: 
本試劑盒采用雙抗體夾心法。用抗人IL-1β 抗體包被于酶標板上，實驗時標本或標準品中的
IL-1β 會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入*化的抗人IL-1β 抗體和辣根過氧
化物酶標記的親和素?？谷薎L-1β 抗體與結合在包被抗體上的人IL-1β 結合、*與親和素特
異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過氧化
物酶的催化下發(fā)出熒光，用化學發(fā)光免疫分析儀測定化學發(fā)光值（RLU），IL-1β 濃度與化學發(fā)
光值之間呈正相關，通過繪制標準曲線求出標本中IL-1β 的濃度。 
樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集
血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA.Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。 
3. 細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。 
4. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，以去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞
會影響測量結果），稱重后將*碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量
體積比，比如1g的組織樣本對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記
錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂
解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分
鐘，取上清檢測。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測 
6. 樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。 
7. 樣品收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃/-80℃冰箱內，避免反復凍融，
1-6月內檢測，4℃保存的應在1周內進行檢測。 
8. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋（建議先
做預實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。 
 
試驗所需自備物品: 
1. 化學發(fā)光免疫分析儀 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
 
檢測前準備工作: 
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結
晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。 
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為500pg/mL）。然后根據(jù)
需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：500、
250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、0pg/mL，樣品稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。如
配制250pg/mL標準品：取0.5mL 500pg/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液
的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 
4. *化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以*化抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗體(1:100)成工作
濃度。當日使用。 
5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。
當日使用。 
6. 發(fā)光底物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制
100-200μL。使用前15分鐘，將發(fā)光底物A液和B液等體積混合。當日使用。 
標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管） 
 
500 250 125 62.5 31.25 15.625 7.813 0 pg/mL 
 
洗滌方法: 
1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。 
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。 
 
操作步驟: 
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。 
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕藴势?amp;樣品稀釋液 100μL，余孔分
別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次
實驗請使用新的標準品溶液。 
2. 棄去孔內液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入*化抗體工作液 100μL（在使用前 15
分鐘內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。 
3. 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內液體拍干。 
4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。 
5. 棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。 
6. 每孔加發(fā)光底物工作液 100μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 5 分鐘左右。 
7. 立即用化學發(fā)光免疫分析儀測定各孔的化學發(fā)光值。應提前打開化學發(fā)光免疫分析儀電源，
預熱儀器，設置好檢測程序。 
8. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。 
注意事項： 
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結果。 
2. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成
任何影響。 
3. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的
“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間控制在
10分鐘內。推薦設置復孔。 
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標
板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 
5. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸
水。 
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，
運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的
液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、*化抗體工
作液、酶結合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請
配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，
一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標
準品、*化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次用量分
裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。 
7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。 
8. 混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。 
9. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。 
10. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外） 
11. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！ 
 
結果判斷: 
1. 每個標準品的化學發(fā)光值（RLU）減去空白孔的化學發(fā)光值后作圖，如設置復孔，則應取其
平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，化學發(fā)光值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以化學
發(fā)光值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。 
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如 curve expert 1.3 或 1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品化學發(fā)
光值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的化學發(fā)光值代入標準曲線
的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 
3. 若標本化學發(fā)光值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。 
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性: 
●靈敏度：zui小可測 4.688pg/mL。 
●檢測范圍：7.813–500pg/mL。 
● 特異性：可檢測重組或天然的人 IL-1β，且與其它相關蛋白無交叉反應。 
● 重復性：板內，板間變異系數(shù)均<15%。 
操作概要 
1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL，37℃孵育 90 分鐘 
2. 倒去孔內液體，加入 100μL *化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘 
3. 洗滌 3 次 
4. 加入 100μL 酶結合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘 
5. 洗滌 5 次 
6. 加入 100μL 發(fā)光底物工作液， 37℃孵育 5 分鐘左右 
7. 立即測定各孔的化學發(fā)光值 
8. 結果計算